תוֹכֶן

• הוראות
• מה שאתה צריך

שיבוט דנ"א, או טכנולוגיית דנ"א רקומביננטי, הוא כלי ביולוגיה מולקולרי שבו גן של עניין (גן היעד) מבודד ומועבר לאורגניזם המשכפל את עצמו, כגון חיידקים פלסמידיים. הקוד הגנטי של פלסמיד חיידקי יהיה לשכפל וליצור עותקים מרובים של הגן הרצוי בכמויות מספיקות כדי להיות מניפולציה ונותחו למטרות מדעיות. שיבוט גנים ניתן להשיג באמצעות פלסמידים אנזימים הגבלה כי יהיה לחתוך את ה- DNA על הקצוות של הגן היעד או גם על ידי ביצוע בדיקה בשם "פולימראז שרשרת התגובה" (PCR) תגובת שרשרת פולימראז ') אשר יגביר את הגן הרצוי.

הוראות

שיבוט PCR עשוי להיות כרוך בצמיחה של תרבויות חיידקים המכילים את הגן הנדרש (חיידקים חיידקים תמונה על ידי ggw מ Fotolia.com)

1. ללמוד להכיר את הטכניקה PCR שיבוט פרוטוקולים. יש הרבה מידע כבר ידוע על הסביבה המדעית על ביולוגיה מולקולרית כי אתה צריך וצריך להבין אם אתה רוצה להצליח שיבוט שלך. פרוטוקולים רבים ערכות שיבוט זמינים מסחרית מחברות כגון Qiagen, Invitrogen, Promega, Applied Biosystems ועוד. לכן, לקבוע מה אתה צריך עבור שיבוט שלך לבחור את החומרים המתאימים והמשאבים.

2. בצע תגובה PCR על הגן שלך של עניין. תהליך ה- PCR כולל מחזורי חימום וקירור כדי להכחיש דנ"א כפול גדילה, הכלאה (או חישול) של שברי דנ"א קטנים הנקראים פריימרס כדי לסמן את הקצוות של הגן המעניין ולבנות גדילים משלימים חדשים של דנ"א באמצעות אנזים שנקרא פולימראז DNA. צעדים אלה חוזרים על 40 עד 50 פעמים, הגברה DNA שלהם מכל מחזור, וכתוצאה מכך אלפי עותקים של הגן היעד. אתה צריך לדעת את רצף הגן, כך שתוכל להשתמש primers המתאים כי יש קישור אקראי בין יוזם לבין האזור הרצוי של הקוד שאתה רוצה להגביר.בהתאם לשיטת השיבוט שלך - קיצוצים פתאומיים בהשלמת גנים מסוימים (בוטה-סוף) או שיבוט של ת"א (כולל קישורים עם תימינים משלימים שנועדו להקל על חיתוך), למשל - ייתכן שיש צורך באנזימי DNA ספציפיים , כגון פולימרז Taq, פולימראז כי הוא thermoable סביר בטמפרטורות גבוהות, אך אין יכולת תיקון נוקליאוטידים, ולכן, לאורך כל הבנייה של גדילי הדנ"א החדש Taq יהיה להגביר את ה- DNA ברצף ולהשאיר מלוכדת הגברה.

   
   

3. אם תרצה, הגנים מוגבר חייב להיות מטוהרים ב PCR. צעד זה ניתן לעשות בכמה דרכים. אחת הדרכים האפשריות היא לסנן דרך עמודות מסתובבות כדי להסיר כל פריימרים הנותרים או אנזימים. לחלופין, אלקטרופורזה ניתן להפעיל נפרד, לחתוך לשטוף את להקות DNA שהושגו.

4. חבר את הגן מטוהרים מוגבר על ידי וקטור פלסמיד PCR מתאים. בערכה שנרכשה מסחרית, וקטור פלסמיד סטנדרטי כגון pGEM או pCR2.1 יסופקו. הגדר את התגובה מחייב שלך לפי ערכה של היצרן או המלצות עבור הכמות הנדרשת של DNA מוגבר, חיץ מחייב, פלסמיד, DNA אנזים ligase. התגובה מחייב יאפשר מעגלית פלסמיד להציג את הגן שלה לתוך הגנום פלסמיד.

5. לבצע תגובה טרנספורמציה שבה וקטור פלסמיד (המכיל הגן שלה) מוכנס לתוך תא חיידקי, לעתים קרובות באמצעות E. coli. הפוך צלחות אגר כמה ימים לפני ההכנה של שלב זה ולשמור את הצלחות באינקובטור. שלב את פלסמיד עם התאים בזהירות רבה על ידי הוספת אמצעי אחסון מגיב באמצעות פעמים דגירה המוזכרים בפרוטוקול אתה משתמש. מורחים את התאים החיידקיים שלך על צלחות אגר, דגירה ב 37 מעלות ולהשאיר אותם בן לילה.

6. הערה על צלחות אגר המושבות של חיידקים כחול לבן. מושבות המכילות את הגן ההכנסה יהיה לבן, לא כחול. בחר כמה מושבות לבן ותרבות אותם בינוני עם מרק lysogenic (LB) עם ampicillin כדי לקבל כמות גדולה של חיידקים עם להוסיף גן משובטים שלהם. לאחר שלב זה תהיה לך הצעה גדולה של הגן מוגבר ו מקודדים. כדי לבצע את ההקרנה של הגן משובטים, להשתמש בערכה זמינה מסחרית לבודד DNA פלסמיד חיידקי לטהר את הגן שלה. לאחסן במקפיא עד הצורך.

   
   

מה שאתה צריך

• ערכות שיבוט זמין מסחרית
• ריאגנטים PCR
• Thermocycler (או PCR מכונת / PCR מכונה)
• אינקובטור
• ציוד מעבדה וציוד
• גן היעד לשיבוט