תוֹכֶן
DNA אינו צף בחופשיות בתוך גרעין התא. זה קשור למספר חלבונים שונים ולכודים בקרום התא. בתאים של בעלי חיים, DNA מכיל גם קרום גרעיני. כדי לחלץ DNA מתא, תחילה יש להסיר את הקרומים והחלבונים הנלווים ואז להפריד אותם באופן פיזי מה- DNA. נתרן עשוי להיות מעורב בכמה מהצעדים שננקטו להשגת מטרה זו.
נתרן כחומר ניקוי
נתרן הוא יסוד. הסמל הכימי שלה הוא Na, מ- Natrium, המילה הלטינית לנתרן. זהו יון חיובי ולעתים קרובות מתקשר ליונים שליליים ליצירת תרכובות שימושיות. לדוגמא, כאשר יוני נתרן נקשרים ליוני כלור, הם יוצרים את התרכובת נתרן כלורי, שהוא מלח השולחן הנפוץ.
בהפקת ה- DNA משתמשים בכמה צורות שונות של נתרן. נתרן דודציל סולפט, או SDS (באנגלית "נתרן דודציל סולפט"), הוא חומר ניקוי המכיל נתרן. יש לו את הנוסחה הכימית של C12H25NaO4S, בה Na מסמל נתרן. משתמשים בחומרי ניקוי לשבירת קירות התא והקרומים. הם עובדים כימית על ידי פתיחת חורים בקרומים או בקירות התא.
לאחר שנפתחו החורים בקרומים, הם יכולים להיהרס מכנית, כמו עם בלנדר. לאחר מכן, קל יותר לקחת את תוכן התא, כולל DNA.
נתרן כחומר אלקליין
נתרן הידרוקסיד הוא תרכובת נוספת המכילה נתרן המשמשת להפקת DNA סלולרי. הנוסחה הכימית לנתרן הידרוקסיד היא NaOH. מתחם זה הוא בסיס. תמיסת נתרן הידרוקסיד היא בסיסית מאוד, או בסיסית. נתרן הידרוקסיד יכול לעבוד על ידי התרופפות המבנה הנוקשה של דופן התא או הממברנה ובכך משחרר DNA.
נתרן הידרוקסיד משמש לרוב להפקת DNA פלסמיד. DNA של פלסמיד בחיידקים הוא בדרך כלל בצורת טבעת בציטופלזמה, נפרד מה- DNA הכרומוזומלי בגרעין. בעוד ש- DNA כרומוזומלי מתכנת את תפקודי התאים החיידקיים ואת התהליכים, דנ"א פלסמיד הוא לרוב דנ"א מהונדס גנטית המקודד גן ספציפי או גנים מעניינים. פלסמידים הם כלי מחקר רב ערך, והפקתם של תאי חיידקים היא הליך שגרתי במעבדות.
כדי להפריד בין DNA כרומוזומלי לבין DNA מקוטע בקטריאלי ל- DNA פלסמיד, משתמשים בתדירות גבוהה של נתרן הידרוקסיד. דנ"א כרומוזומלי ומקוטע הוא ליניארי, ואילו דנ"א פלסמיד הוא מעגלי. כאשר התמיסה בסיסית - למשל כאשר מוסיפים נתרן הידרוקסיד - נפרדות מולקולות דנ"א גדילי גדילים. זה מכונה דנטורציה. הבסיסים המשלימים שלהם כבר אינם קשורים זה לזה. אתה יכול לחשוב על זה כשני הצדדים המשלימים של רוכסן. כאשר ה- DNA גדיל כפול, הרוכסן סגור. כאשר ה- DNA מפוגל, הרוכסן לא רק פתוח, אלא ששני הגדילים מופרדים לחלוטין זה מזה, כמו במעיל.
מצד שני, מולקולות DNA של פלסמיד, אף על פי שרוכסן פתוח, אינן מופרדות. הרצועות המעגליות יכולות למצוא בקלות את בסיסיהן המשלימים ול"תחדש "את עצמן בחזרה למולקולת DNA פלסמיד עגולה דו-גדילית, ברגע שהפתרון כבר אינו בסיסי. זהו אחד המאפיינים הייחודיים של פלסמידים, המאפשרים להפריד אותם עם ה- DNA הכרומוזומלי. באופן זה ניתן להסיר DNA פלסמיד עם הגן המבוקש ולעניין אותו מה- DNA הכרומוזומלי הרגיל של החיידק.
תפקיד הנתרן אצטט
נתרן יכול להיות גם בצורה של נתרן אצטט. בדומה לנתרן הידרוקסיד, נתרן אצטט משמש לסייע בהפרדת דנ"א פלסמיד מדנ"א כרומוזומלי, אך על ידי מנגנון שונה מאוד ובזמן אחר מאשר הליך מיצוי הדנ"א.
קווצות ייחודיות של DNA ליניארי אינן מסיסות בתמיסות מלוחים. הם מזרזים ויוצרים מוצק.הוספת נתרן אצטט לפתרונות דטרגנט SDS יוצרת מוצקים של פסולת תאים, כמו גם DNA ליניארי כרומוזומלי מפוגל. DNA פלסמיד מעגלי אינו מסיס בתמיסות מלוחים. הוא נשאר בתמיסה, ומפריד בין ה- DNA הרצוי לפלסמיד לבין שאר ה- DNA בתא.
נתרן הידרוקסיד מספק את הפיתרון הבסיסי לגמישות DNA נפרדות ולהפרדה, הן פלסמיד והן כרומוזומלי. ברגע שה- DNA כבר לא נמצא בתמיסה האלקליין, רק ה- DNA של הפלסמיד יכול להתארגן מחדש. כדי להפריד דנ"א כרומוזומלי מפוגל ו"פתוח "לבין דנ"א פלסמיד המושתר ו"סגור", משתמשים בנתרן אצטט לזרז סלקטיבי דנ"א כרומוזומלי ופסולת תאית הרחק מדנ"א פלסמיד כפול גדילי.
תפקיד הנתרן במשקעי ה- DNA
ניתן להסיר את ה- DNA הכרומוזומלי המזורז ופסולת תאים מה- DNA הפלסמיד המסיס שנמצא עדיין בתמיסה באמצעות צנטריפוגה, תהליך סיבוב מהיר שגורם לזריקת המוצקים לתחתית הצינור בצורת טבליה קטנה. המאפשרת להפריד את הנוזל בחלקו העליון, המכיל DNA פלסמיד.
לאחר מכן ניתן לזרז את ה- DNA של הפלסמיד על ידי הוספת אלכוהול ומלח לתמיסה. לרוב רצוי לזרז דנ"א פלסמיד לריכוז הכמות שלו בתמיסה ולהחזירו לתמיסה המסייעת לייצב את המבנה הכימי שלו. המלח המשמש לזרזת DNA של פלסמיד יכול להיות נתרן כלורי או נתרן אצטט, למשל, אך הוא יכול להיות גם אמוניום אצטט או ליתיום כלורי.
נתרן הוא יון טעון חיובי. בתמיסת נתרן כלורי - מלח שולחן, למשל - מולקולת הנתרן כלורי נפרדת ליוני נתרן ויוני כלוריד. לעומת זאת, ה- DNA טעון שלילית ביותר. המטען השלילי הגבוה של מולקולת ה- DNA מנוטרל על ידי יוני הנתרן החיוביים בתמיסה. ניטרול זה מאפשר ל- DNA לזרום באלכוהול. ללא המלח, ה- DNA נשאר טעון שלילית ונשאר בחלק המימי של התמיסה.
אם תערובת זו עוברת צנטריפוגה, ה- DNA הפלסמידי המשקע יהפוך לגלולה בתחתית הצינור. ניתן להסיר את החלק הנוזלי ואז להחזיר את ה- DNA לתמיסה, או להשעות אותו מחדש בתמיסה אחרת בריכוז הרצוי.
נתרן כחלק מתמיסת החיץ
בדרך כלל מושעה DNA מחדש בתמיסה המכילה טריס ו- EDTA. זה נקרא פתרון חיץ. EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) הוא החומר הכימי חומצה tetraacetic אתילנדיאמין, שקיימת בדרך כלל במעבדה כמלח דיודיום, Na2C10H16N2O8. פתרונות חוצץ משמשים למניעת שינויים דרסטיים ב- pH; במקרה זה, טריס / EDTA שומר את ה- DNA בתמיסה עם pH בין 7.0 ל -9.0.
